秸秆EM菌种发酵设备，微生物菌种发酵设备

　生产环境及生产车间要求

生产环境

—— 厂区空气质量达到大气环境质量标准GB 3095-1996中Ⅱ类标准要求；

—— 发酵用水达到地表水质量标准GB 3838-2002中Ⅲ类水质要求，冷却水及其他用水达到标准中Ⅳ类水质要求；

生产车间

—— 发酵车间与吸附等后处理车间距离适当，相对隔离，有密闭且可以灭菌的传输通道；

—— 菌种的储藏间、无菌操作间与生产车间相对隔离；

—— 发酵等生产关键性车间采用双路供电或备用一套发电机。

—— 建立定期用消毒剂进行生产设备和环境消毒的车间环境卫生制度。

　生产技术流程

农用微生物菌剂的一般生产技术环节为：菌种→种子扩培→发酵培养→后处理→包装→产品质量检验→出厂。流程图见附录A。

 

原种

原种是生产用菌种的母种，对原种的要求如下：

—— 有菌种鉴定报告；

—— 菌种的企业编号、来源等信息。

　菌种的保存和管理

—— 采用合适的方式保存菌种，确保无杂菌污染，菌种不退化。应选用一种以上适宜的方法保藏，常见菌种类型及相应保藏方式见附录B；

—— 分类存放，定期检查；

—— 建立菌种档案。

菌种质量控制

在生产之前，应对所用菌种进行检查，确认其纯度和应用性能没有发生退化。出现污染或退化的菌种不能作为生产用菌种，需进行4.1.4或4.1.5操作。

　菌种的纯化

菌种不纯时，应进行纯化。可采用平板划线分离法或稀释分离法，得到纯菌种。必要时可采用显微操作单细胞分离器进行菌种分离纯化。

对纯化的菌种应进行生产性能的检查。

菌种的复壮

菌种发生下列现象之一，应进行菌种复壮：

—— 菌体形态及菌落形态发生变化；

—— 代谢活性降低，发酵周期改变；

—— 重要功能性物质的产生能力下降；

—— 其他重要特性的退化或丧失；

菌种复壮方法：回接到原宿主或原分离环境传代培养，重新分离该菌种。

　发酵增殖

 

种子扩培

原菌种应连续转接活化至生长旺盛后方可应用。

种子扩培过程包括试管斜面菌种、摇瓶（或固体种子培养瓶）、种子罐发酵（或种子固体发酵）培养三个阶段，操作过程要保证菌种不被污染、生长旺盛。

培养基

培养基重要原料应满足一定的质量要求，包括成分、含量、有效期以及产地等。对新使用的发酵原料需经摇瓶试验或小型发酵罐试验后方可用于发酵生产。

种子培养基

种子培养基要保证菌种生长延滞期短，生长旺盛。原料应使用易被菌体吸收利用的碳、氮源，且氮源比例较高，营养丰富完全，有较强的pH缓冲能力。后一级种子培养基主要成分应接近发酵培养基。

　发酵培养基

发酵培养基要求接种后菌体生长旺盛，在保证一定菌体（或芽胞、孢子）密度的前提下兼顾有效代谢产物。原料应选用来源充足、价格便宜且易于利用的营养物质，一般氮源比例较种子培养基低。

可采用对发酵培养基补料流加的方法改善培养基的营养构成以达到高产。

灭菌

常用的灭菌方式及适用对象见附录C。

　高压蒸汽灭菌操作要求

a)    液体培养基、补料罐（包括消泡剂）、管道、发酵设备及空气过滤系统灭菌温度为121℃~125℃(压力0.103Mpa~ 0.168Mpa)，0.5h~1.0h。液体培养基装料量为50%~75%发酵罐容积。

b)    固体培养基物料灭菌温度为121℃~130℃，1.0h ~2.0h；或采用100℃灭菌2h~4h，24h后再灭菌一次。

c)    在高温灭菌会产生对菌体生长有害物质或对易受高温破坏物料灭菌时，应采用物料分别灭菌或降低灭菌温度延长时间。

培养基灭菌后按4.2.3.2进行检查。若灭菌不彻底，培养基不得使用。

灭菌效果检查

采用显微镜染色观察法和/或发酵管试验法检查培养基的灭菌效果。

　染色观察法

a)     对待检测培养基无菌操作取样，在洁净载玻片上涂片、染色、镜检。

b)     若镜检发现有菌体，即可认为灭菌不彻底，需要进行4.2.3.2.2操作，无活菌体后培养基方可使用。

c)     若未发现菌体，初步认为灭菌彻底，培养基可以使用。在必要时,可进行4.2.3.2.2操作，以进一步确认培养基灭菌彻底。

　发酵管试验法

用无菌操作技术将1mL供试培养基加至5mL已灭菌的营养肉汤中，重复三次。置于37℃培养，24h内无浑浊、镜检无菌体即可认为灭菌彻底。反之，即可判定培养基灭菌不彻底。

无菌空气

发酵生产中所通入的无菌空气采用过滤除菌设备制得，空气过滤系统应采用二级以上过滤。对制得的无菌空气按如下步骤检验合格后方可用于发酵生产。

用无菌操作技术，向装有100mL～200mL无菌肉汤培养基的三角瓶中通入待监测滤过空气10min～15min。三角瓶置于37℃培养，24h内无浑浊、镜检无菌体即判定合格。